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Toxin實驗報告
發(fā)布時間： 2023-03-23 點擊次數(shù)： 1111次北京華新康信現(xiàn)貨 大力回饋新老客戶，現(xiàn)貨打折出售，現(xiàn)有品牌和種類，新老客戶可以自由選購：Toxin北京試劑toxin常見問題與解答 Toxin上海試劑toxin試劑 toxin廣東試劑toxin深圳試劑toxin河北試劑toxin上海試劑toxin北京試劑 toxin安徽試劑 toxin河南試劑
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BNIP3調(diào)節(jié)惡性周邊神經(jīng)腱鞘瘤細胞中的 AT101[(-)-棉酚]誘導的死亡
更正2015年8月27日: Kaza N，Kohli L，Graham CD，Klocke BJ，Carroll SL，et al。(2015)更正: BNIP3調(diào)節(jié) AT101[(-)-棉酚]誘導的惡性周邊神經(jīng)腱鞘瘤細胞死亡。PLOS ONE 10(8) :
惡性外周神經(jīng)鞘腫瘤(MPNST)是一種侵襲性雪旺細胞來源的肉瘤，是導致神經(jīng)纖維瘤(NF1)患者死亡的主要原因。目前的治療方法在很大程度上是無效的，導致 MPNST 復發(fā)率高，5年患者生存率差。這就需要對 MPNST 患者進行替代化方案的探索。本研究旨在評估 BH3-模擬物 AT101[(-)-棉酚]在體外對 MPNST 細胞的細胞毒作用，并鑒定 AT101誘導的 MPNST 細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。我們發(fā)現(xiàn) AT101引起半胱天冬酶非依賴性，非凋亡性 MPNST 細胞死亡，伴隨著自噬，并通過 HIF-1α 誘導的非典型 BH3-only 蛋白 BNIP3的表達介導。這些作用是由細胞內(nèi)鐵螯合介導的，這是以前未報道的 AT101細胞毒性機制。
引文: Kaza N，Kohli L，Graham CD，Klocke BJ，Carroll SL，Roth KA (2014) BNIP3調(diào)節(jié) AT101[(-)-棉酚]誘導的惡性周邊神經(jīng)腱鞘瘤細胞死亡。PLoS ONE 9(5) : e96733. 斯賓塞 · 吉布森，曼尼托巴大學，加拿大收到: 2013年12月19日; 接受: 2014年4月10日; 發(fā)表: 2014年5月13日版權(quán): 2014 Kaza et al。這是一篇開放獲取的文章，根據(jù)知識共享的署名許可條款分發(fā)，允許在任何媒體上不受限制地使用、分發(fā)和復制，只要原作者和來源被署名。資金: 這項工作得到了國家癌癥研究所贈款 CA134773(KAR，SLC)和 CA122804(SLC) ，全國神經(jīng)紊亂和中風研究院贈款 NS41962(KAR)和國防部贈款 X81XWH-09-1-0086和 W81XWH-12-1-0164(SLC)的支持。資助者在研究設計、數(shù)據(jù)收集和分析、決定發(fā)表或準備稿件方面沒有任何作用。相互競爭的利益: 作者宣稱不存在相互競爭的利益
惡性外周神經(jīng)鞘瘤(MPNST)是高度侵襲性的雪旺細胞來源的肉瘤，經(jīng)常發(fā)生于良性叢狀神經(jīng)纖維瘤[1]。大約一半的多發(fā)性神經(jīng)營養(yǎng)不良癥是零星出現(xiàn)的，其余的發(fā)生在神經(jīng)纖維瘤(NF1)患者中。NF1是影響人類神經(jīng)系統(tǒng)的最常見的遺傳性常染色體顯性遺傳病，在3500名新生兒中發(fā)生1例，NF1患者中有8-13% 在其一生中發(fā)展為 MPNST [3]。目前治療 MPNST 的標準是手術(shù)，然而，完整的手術(shù)切除往往是不可能的，MPNST 侵襲鄰近組織和轉(zhuǎn)移[4]。放治療抑制局部 MPNST 復發(fā)，但不增加患者生存率。化同樣無效。因此，MPNST 是 NF1患者死亡的主要原因[5]。鑒于這些有限的治療選擇和 MPNST 的攻擊性行為，需要新的治療方法。通過逃避細胞凋亡來抵抗細胞死亡的能力是腫瘤細胞的一個標志[6]。這種癌細胞特征部分反映了調(diào)節(jié)內(nèi)在線粒體凋亡途徑的促凋亡和抗凋亡 BCL-2蛋白之間平衡的失調(diào)[7]。BCL-2家族的抗凋亡成員(BCL-2，BCL-xL，BCL-w，MCL-1和 A-1)通過與包埋在線粒體外膜中的多結(jié)構(gòu)域促凋亡成員(BAX 和 BAK)結(jié)合來抑制細胞凋亡。許多癌癥過度表達 BCL-2家族的抗凋亡成員，并對死亡刺激具有抗性[8]。與叢狀神經(jīng)纖維瘤相比，MPNST 表達高水平的 BCL-xL，這被認為與其化耐藥性有關(guān)[9]。此外，抑制 BCL-xL 使 NF1衍生的 MPNST 細胞對化敏感[10]。
AT101[(-)-棉酚乙酸]是棉酚的一種改性左旋對映體，棉酚是存在于棉籽中的一種天然多酚醛[11]。盡管自20世紀60年代中期以來，棉酚作為抗腫瘤藥物的使用已被探索[12] ，[13] ，但在2000年代初被發(fā)現(xiàn)是 BH3模擬物時，它作為一種可行的抗癌藥物重新受到關(guān)注[14]。BH3模擬物與 BCL-2同源結(jié)構(gòu)域3-only (BH3-only)蛋白相似，并與抗凋亡 BCL-2蛋白的 BH3結(jié)合溝相互作用，從而阻止其與促凋亡 BCL-2家族蛋白 Bax 和 Bak 的相互作用。先前已經(jīng)表明，棉酚抑制 BCL-2，BCL-xL 和 MCL-1的抗凋亡功能[15]。有趣的是，棉酚之前也作為一種男性抗生育藥物在臨床試驗中進行了測試[16] ，[17]。棉酚的抗生育作用被認為是由于抑制精原細胞的能量代謝[18] ，而不是其作為 BH3模擬物的作用。其他幾種細胞毒作用模式也歸因于棉酚，包括抑制 DNA 合成和細胞周期停滯[19] ，改變細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)[20] ，抑制蛋白激酶C [21] ，與類固醇受體共激活因子的相互作用[22]和調(diào)節(jié)線粒體凋亡信號傳導的幾個組分[23]。最近也有證據(jù)表明棉酚可以誘導自噬，在某些情況下導致自噬性細胞死亡[24]。鑒于這些多重作用，棉酚誘導任何特定腫瘤類型的細胞死亡的主要機制可能會有所不同，這取決于抗凋亡 BCL-2蛋白和其他腫瘤細胞特異性因子的水平。
本研究的目的是確定 AT101是否在體外對 MPNST 細胞發(fā)揮細胞毒作用，并探討其潛在的分子作用機制。我們發(fā)現(xiàn) AT101引起 MPNST 細胞半胱天冬酶非依賴性的非凋亡性細胞死亡，伴隨的自噬不具有細胞保護作用。我們顯示 AT101誘導 BCL-2/E1B-19K 相互作用蛋白3(BNIP3)的表達，BNIP3是一種非典型的僅 BH3蛋白，其促進 AT101誘導的細胞死亡。我們還證明 BNIP3的表達是通過缺氧誘導因子 -1α (HIF-1α)的核內(nèi)積累來促進的，HIF-1α 可以通過補鐵來消除。我們的研究結(jié)果進一步認為 AT101細胞毒性的機制之一是螯合細胞內(nèi)鐵。抗體和其他試劑
從以下來源獲得一抗: HIF-1α，BECLIN1，BIM，BCL-xL，β-微管蛋白，鐵蛋白 HC 和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 -1(TfR1/CD71; Santa Cruz Biotechnology Inc. ，Santa Cruz，CA) ; BNIP3(Sigma，St. Louis，MO) ; Lamin A/C (BD TransductionLaboratories，Franklin lake，nJ) ; GAPDH，BCL-2和 PUMA (Cell Signaling，丹弗斯，MA) ; LC3(Abgent，San Diego，CA)。分別從 Biorad (Hercules，CA)和 Cell Signaling (Danvers，MA)獲得辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔和馬抗小鼠抗體。 AT101由 Ascenta Therapeutics (Malvern，PA)提供。BOC- 天冬酰胺(Ome)-氟甲基酮(BAF)和檸檬酸鐵購自 MP Biomedicals (Aurora，OH) ，Bafilomycin A1(BafA1)來自 A.G. Scientific (San Diego，CA)和3-甲基腺嘌呤(3MA) ，星孢菌素(STS) ，甲磺酸去鐵胺(DFO) ，來自 Sigma (St.Louis，MO)的二甲基亞砜(DMSO)。ABT-737購自 TX 休斯敦的塞萊克化工有限公司
Cell CultureWe 先前描述了本研究中使用的人 NF1相關(guān)的 MPNST 系 T265-2c 細胞，ST88-14細胞和90-8細胞的來源[25]。這些細胞系的身份按照 ATCC 技術(shù)公報8中概述的規(guī)范進行例行驗證。簡而言之，細胞的形態(tài)和倍增次數(shù)是常規(guī)評估的，細胞的身份是通過微衛(wèi)星分析來驗證的。細胞也定期檢測支原體感染。將所有細胞系在含有1% 青霉/鏈霉(Invitrogen，卡爾斯巴德，CA) ，1% L- 氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)和10% 胎牛血清(FBS; Hyclone，Logan，UT)的 DMEM10[ DMEM (Sigma，St.Louis，MO)]中培養(yǎng)，并在37 °C 下在潮濕的5% 二氧化碳，95% 空氣氣氛中溫育。將細胞以20,000/孔的密度鋪在未涂布的48孔板上，并以106個細胞/培養(yǎng)皿的密度鋪在100mm 培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)物用于實驗后24小時電鍍。在補充有5% FBS 的培養(yǎng)基中進行藥物治療。細胞活力，Cytotoxicity，細胞凋亡和體外半胱天冬酶切割測定使用 calcein-AM (Life Technologies，卡爾斯巴德，CA)轉(zhuǎn)化測定來測量細胞活力。使用化學底物 devD-7-氨基 -4-甲基豆素(AMC)(Enzo Life Sciences，Framingdale，NY) ，用體外半胱天冬酶 -3切割測定評估半胱天冬酶活化。這兩種檢測方法均如前所述進行[26]。使用哺乳動物細胞的 LIVE/DEAD 活力/細胞毒性試劑盒和來自分子探針公司公司(Eugene，OR)的 Annexin V Alexa Fluor 488和碘化丙啶的死細胞凋亡試劑盒評估細胞毒性和細胞凋亡。遵循制造商的指示，并使用 BD FACSCalibur 流式細胞儀測量乙錠同型二聚體 -1，Alexa Fluor 488和碘化丙啶的熒光。
通過去除培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細胞，用細胞提取器刮除細胞，然后通過以3000rpm 離心10分鐘將它們沉淀來制備全細胞裂解物。將細胞沉淀重懸于含有20mM Tris-HCl (pH7.4) ，150mM NaCl，2mM EDTA，1% Triton X-100,10% 甘油，蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，MO)和磷酸酶抑制劑雞尾酒1和3(Sigma，St.Louis，MO)。將裂解物澄清并儲存在 -80 °C。30μg 蛋白質(zhì)按照我們之前描述的方案進行免疫印跡[27]。除 GAPDH 和 LAMIN (1∶5000)外，其余一抗均稀釋至1∶1000。通過增強型化學發(fā)光(Pierce ECL; Thermo Scientific，沃爾瑟姆，MA)檢測免疫活性物種。按照制造商的說明，使用 NE-per 提取試劑盒(Thermo Scientific，沃爾瑟姆，MA)提取核和細胞質(zhì)部分。
一抗在以下工作濃度下使用: LC3(Abgent; 1∶1000) ，BNIP3(Sigma; 1∶100)。HRP 綴合的抗兔超級圖片(Invitrogen; 用于 LC3)和抗小鼠 ImmPRESS (Vector Laboratories; 用于 BNIP3)均以1∶100稀釋使用。使用 Cy3(Perkin-Elmer Life Science Products)的酪胺信號擴增系統(tǒng)檢測免疫反應性。雙苯并酰亞胺(1μg/mL; Hoechst 33258; Sigma)用于核復染。樣品使用裝有 AxioCam 數(shù)碼相機的蔡司 Axioskop 熒光顯微鏡進行檢查。使用 Axio Vision Rel 捕獲和分析圖像。4.8軟件(卡爾蔡司顯微成像)。用 RNeasy Plus 微型試劑盒(Qiagen)分離了逆轉(zhuǎn)錄和實時定量 PCR RNA。隨后使用高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)合成 cDNA。使用 Maxima SYBR Green/ROX qPCR 主混合物(Thermo Scientific，沃爾瑟姆，MA)進行實時定量 PCR 測定，并從 Life Technologies (Carlsbad，CA)獲得探針。在 Stepone Plus 實時 PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)中進行擴增。從 Harvard PrimerBank 中選擇以下正義/反義引物和探針，用于檢測人 BNIP3(5’-TGAGTCTGGACGGAGTAGCTC-3’和5’-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTGT-3’) ，HIF-1α (5’-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG-3’和5’-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3’) 用 ΔΔCT 方法(Livak and Schmittgen，2001)進行分析，并使用 ACTIN RNA 水平作為參考對數(shù)值進行調(diào)整。
RNAiBNIP3和 HIF-1αsiRNA (siGENOME SMARTPool)購自 Thermo Scientific (Waltham，MA) ，并根據(jù)制造商的說明重新構(gòu)建。將細胞鋪在 DMEM10中，并在鋪板后24小時使用 X-tremeGene siRNA 轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Indianapolis，IN)以5∶2的比例轉(zhuǎn)染[轉(zhuǎn)染試劑(μl) : 寡核苷酸(μg)]。第二天，新鮮培養(yǎng)基被添加到細胞中。轉(zhuǎn)染后48小時復制轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后72小時處理。使用來自 Teco Diagnostics (Anaheim，CA)的 Iron/TIBC 試劑組的修改方案，在無細胞系統(tǒng)中評估 AT101，ABT737和 DFO 的鐵結(jié)合特性。簡而言之，對測量不飽和鐵結(jié)合能力(UIBC)的方案進行了修改，以評估溶液中相應藥物的鐵結(jié)合能力。將等體積的 UIBC 緩沖液(Tris 緩沖液0.5 M，pH8.0，表面活性劑和氮化鈉)加入到所有孔中，然后等體積的鐵標準物與試劑盒一起供應，空白除外。不同濃度的 AT101，ABT737和 DFO 被添加到各自的井和體積平衡的無鐵水。在560nm 讀取基線吸光度后，向所有孔中加入等體積的鐵顯色劑(鹽酸羥胺中的 Ferrozine 16.6 mM) ，并將平板在37 °C 溫育10分鐘。孵育后，在560nm 處再次讀取吸光度。根據(jù)制造商的說明書計算鐵的含量。
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