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我應(yīng)該使用哪種藥物選擇標(biāo)記？
VectorBuilder在其載體上提供了多種藥物選擇標(biāo)記，如嘌呤霉素（Puro）、新素（Neo）、潮霉素B（Hygro）和blasticin（Bsd）。總的來說，我們發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素比其他抗生素更快、更穩(wěn)定地殺死非耐藥細(xì)胞。因此，我們建議大多數(shù)細(xì)胞類型使用Puro。然而，一些細(xì)胞類型可能在沒有耐藥性基因的情況下自然對(duì)某些抗生素具有一定程度的耐藥性，或者即使有耐藥性基因，它們也對(duì)某些抗生素敏感。這些細(xì)胞需要測(cè)試不同的藥物選擇標(biāo)記物，以找到最佳的標(biāo)記物。
常用藥物的推薦濃度和選擇時(shí)間
抗生素細(xì)胞系推薦濃度推薦持續(xù)時(shí)間
嘌呤霉素293T 1-2微克/毫升3-5天
Geneticin（G418）HT1080 500-1000 ug/ml 7-11天
Blasticidin 293T 5-15 ug/ml 7-11天
潮霉素B 293T 100-200微克/毫升5-7天
我們的VectorAcademy文章《增強(qiáng)培養(yǎng)：如何改善細(xì)菌生長(zhǎng)》為優(yōu)化抗生素濃度以及其他培養(yǎng)條件以提高質(zhì)粒產(chǎn)量提供了指南。
筆記
a.使用Geneticin（G418）來選擇表達(dá)新素抗性基因的細(xì)胞。
b.頻繁地使細(xì)胞傳代可以加速殺細(xì)胞素的選擇。
閱讀更多關(guān)于我們的藥物選擇標(biāo)記物集合的信息
流行的ORF
VectorBuilder提供了許多流行的矢量組件，用戶在設(shè)計(jì)矢量時(shí)可以從中進(jìn)行選擇。下表提供了有關(guān)這些流行組件的詳細(xì)信息，這些組件按類別單獨(dú)列出。
名稱描述應(yīng)用程序說明參考序列
大腸桿菌β-半乳糖苷酶的ORF_Stuffer氨基酸2-83可用作陰性ORF對(duì)照。由VectorBuilder設(shè)計(jì)
熒光記者
名稱描述應(yīng)用說明顏色結(jié)構(gòu)最大激發(fā)（nm）最大發(fā)射（nm）亮度（EGFP的%）參考序列
EGFP增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；基于野生型GFP變體優(yōu)化的密碼子，該變體來自水母維多利亞綠錐蟲常用的綠色熒光蛋白；在所有熒光蛋白中亮度、光穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都很高。綠色單體（可形成弱二聚體）484 507 100核酸研究24:4592（1996）
NLS-EGFP-EGFP具有核定位信號(hào)的兩端核定位。綠色單體（可能形成弱二聚體）484 507 100由VectorBuilder設(shè)計(jì)
sfGFP來自維多利亞綠錐蟲的超級(jí)折疊綠色熒光蛋白；GFP變體S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和A20
我什么時(shí)候應(yīng)該使用熒光蛋白、螢光素酶或LacZ？
熒光蛋白、熒光素酶和LacZ都是基于重組蛋白的報(bào)告子，可用于定位或成像研究。然而，這些系統(tǒng)在幾個(gè)重要方面有所不同，這決定了它們適用于不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
熒光蛋白和螢光素酶都是發(fā)光的蛋白質(zhì)類型，然后可以用相機(jī)或類似設(shè)備檢測(cè)到。熒光蛋白的功能是吸收一種顏色的光（激發(fā)），然后發(fā)射不同顏色的低能量光（發(fā)射）。相反，螢光素酶（和其他生物發(fā)光酶）通過催化底物（即螢光素）被氧化的化學(xué)反應(yīng)來產(chǎn)生光，并作為反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)射光子。
熒光蛋白比螢光素酶亮得多，螢光素酶有利于許多類型的實(shí)驗(yàn)，但在組織樣本或活體動(dòng)物中，背景、自發(fā)熒光和光散射
我應(yīng)該使用哪種熒光蛋白？
多年來已經(jīng)開發(fā)了許多熒光蛋白，在實(shí)驗(yàn)中使用哪種熒光蛋白取決于許多因素。
單色實(shí)驗(yàn)
對(duì)于單色實(shí)驗(yàn)，綠色FPs是最常見的選擇。EGFP是受歡迎的綠色FP，是許多單色研究的好選擇。然而，其他綠色FP，如TurboGFP（又名maxGFP），可能是某些應(yīng)用的更好選擇。例如，與EGFP相比，TurboGFP具有許多更*的功能，如更亮的綠色熒光、更快的成熟、高pH和光穩(wěn)定性，使其成為受益于早期信號(hào)檢測(cè)和高靈敏度的實(shí)驗(yàn)的理想選擇。如果首紅色FP，mCherry由于其單體結(jié)構(gòu)、良好的熒光性能和低毒性，是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的佳選擇。它特別適用于蛋白質(zhì)標(biāo)記或當(dāng)細(xì)胞對(duì)可能發(fā)生的毒性或蛋白質(zhì)聚集敏感時(shí)
多色實(shí)驗(yàn)
對(duì)于同時(shí)使用多個(gè)熒光團(tuán)（包括FP和DAPI等其他染料）的多色實(shí)驗(yàn)，研究人員必須仔細(xì)考慮熒光團(tuán)的光譜特性，以確保基于可用顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光檢測(cè)中使用的其他硬件上的激發(fā)和/或發(fā)射濾光片，熒光團(tuán)在光譜上是可區(qū)分的。基本上，檢測(cè)硬件應(yīng)該能夠在不受其他熒光團(tuán)干擾的情況下從實(shí)驗(yàn)中使用的多個(gè)熒光團(tuán)中的每一個(gè)讀出熒光信號(hào)。這可以通過使用激發(fā)濾波器（或激光器）來產(chǎn)生僅激發(fā)感興趣的熒光團(tuán)的適當(dāng)頻率的激發(fā)光來實(shí)現(xiàn)。也可以通過使用發(fā)射濾波器僅允許來自感興趣的熒光團(tuán)的發(fā)射熒光進(jìn)入檢測(cè)器來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于兩種顏色，標(biāo)準(zhǔn)的綠色FP（如EGFP）加上標(biāo)準(zhǔn)的紅色FP（如mCherr）
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）
FPs廣泛應(yīng)用于許多基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的應(yīng)用中。FRET是一個(gè)物理過程，在此過程中，激發(fā)的供體發(fā)色團(tuán)分子通過非放射性偶極-偶極耦合將能量轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)。在觀察中，FRET導(dǎo)致供體熒光的減少和受體發(fā)射的增加。FRET有幾個(gè)先決條件：供體和受體必須非常接近（10-100?）；受體的激發(fā)光譜必須與供體的發(fā)射光譜重疊；供體和受體的躍遷偶極取向必須平行。FRET依賴于距離，并且FRET的效率與供體和受體之間的距離的六次方成反比。因此，它對(duì)距離的微小變化非常敏感，使其成為許多應(yīng)用中的強(qiáng)大工具，例如研究DNA或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行投資
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